微生物鑒定實驗檢測原理

不同的細菌具有各自的*的酶系統(tǒng)，因而對底物的分解能力各異，其代謝的產(chǎn)物也不相同。這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生物化學特性，可利用生物化學的方法測定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細菌。掌握各種生化反應的原理和應用是細菌鑒定的基礎(chǔ)。生理生化特性的測定主要根據(jù)Shirling & Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鑒定的有關(guān)試驗。 

 信帆生物對質(zhì)量的控制涵蓋生物試劑、放行、市場質(zhì)量反饋的全過程,包括原輔料、包裝材料、工藝用水、中間過程及成品的質(zhì)量標準和分析方法的建立、取樣、檢驗和產(chǎn)品穩(wěn)定性考察和市場不良反饋樣品的復核等工作,確保產(chǎn)品的精確度、穩(wěn)定性。我們確保銷售給客戶的產(chǎn)品是能夠符合質(zhì)量標準,適合客戶要求的產(chǎn)品。

（一）碳水化合物代謝實驗 

糖（醇、苷）類發(fā)酵實驗 

（1）原理： 細菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關(guān)，故分解糖的能力各不相同，細菌分解糖類后的終產(chǎn)物亦不一致，在含糖培養(yǎng)基中加入指示劑，若細菌分解糖則產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養(yǎng)基顏色改變，從而判斷細菌是否分解某種糖或其他碳水化合物 

（2）基本培養(yǎng)基： 在培養(yǎng)基中加入0.5%～1%的糖類（單糖、雙糖、或者多糖）、醇類（甘露醇、肌醇）苷類（水楊苷、菊糖等）。培養(yǎng)基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。 

（3）實驗方法： 取某一種細菌的24h純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果并記錄。 

（4）結(jié)果判定： 如果接種進去的細菌可發(fā)酵某種糖或醇，則可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基由紫色變成黃色，如果不發(fā)酵，則仍保持紫色。如，發(fā)酵的同時又產(chǎn)生氣體，則在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。 

（5）應用： 是鑒定細菌主要基本的實驗，特別是對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。 

氧化型與發(fā)酵型(O/F)的測定 

（1）原理： 細菌在分解葡萄糖的過程中，必需有氧的參加的，稱為氧化型，細菌在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解的，稱為發(fā)酵型。發(fā)酵型細菌無論在有氧或者無氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。這在區(qū)別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。 

（2）培養(yǎng)基： 培養(yǎng)基蛋白胨2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，葡萄糖10g，瓊脂3g，1％溴麝香草酚藍3mL，蒸餾水1000mL。將蛋白胨、鹽、瓊脂和水混合，加熱溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示劑，加熱溶解；分裝試管，3～4mL/管；115℃，高壓蒸汽滅菌20min，取出后冷卻成瓊脂柱。 

（3）實驗方法： 挑取18～24h的幼齡斜面培養(yǎng)物，穿刺接種，每種細菌接種兩管，于其中1管覆蓋1mL滅菌的液體石蠟，37℃培養(yǎng)24小時或更長時間。 

（4）結(jié)果判定。

 Β-半乳糖苷(ONPG)實驗 

（1）原理： 有的細菌可以產(chǎn)生β一半乳糖苷酶，能分解鄰－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黃色的鄰－硝基酚，在很低濃度下也可以檢測出。 

（2）培養(yǎng)基： 鄰硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0.01mol／L pH7.5磷酸緩沖液1000mL，pH7.5的滅菌1%蛋白胨水300mL。先將前兩種成分混合溶解，過濾除菌，在無菌條件下與1％蛋白胨水混合，分裝試管，每管2～3mL，無菌檢驗后備用。 

（3）實驗方法： 取一環(huán)細菌純培養(yǎng)物接種在ONPG培養(yǎng)基上置37℃培養(yǎng)1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，會在3h內(nèi)產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚；如無此酶，則在24h內(nèi)不變色。 

七葉苷水解實驗 

（1）原理： 有的細菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應，生成黑色的化合物，使培養(yǎng)基呈黑色。 

（2）應用： 主要用于腸球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽性，后者陰性，也可用于革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。 

甲基紅實驗 

（1）原理： 細菌分解培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)酸，當產(chǎn)酸量大，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑而變紅，為甲基紅試驗陽性。若細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如，醇、酮、醛、氣體和水等）則培養(yǎng)基的pH值仍在pH6.2以上，故加入甲基紅試劑呈黃色，為陰性。 

（2）實驗方法： 一種細菌的24h培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)48～72h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養(yǎng)液呈紅色者為陽性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。 

（3）應用： 主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽性后者為陰性。

 V-P實驗 

（1）原理： 有些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸, 丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中，被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基發(fā)生反應生成紅色的化合物。若培養(yǎng)基中的胍基含量過少，則可加入少量含胍基的化合物等。 

（2）V-P試劑： 肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。 

（3）實驗方法： 接種實驗菌于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(與甲基紅實驗相同)中，每次兩個重復，置適溫培養(yǎng)2-6d，取培養(yǎng)液和40%NaOH等量相混，加入少許肌酸，10min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為實驗陽性反應，有時需要放置更長時間才出現(xiàn)紅色反應。 

（4）應用： 本實驗常與甲基紅實驗一起用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。 

（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝實驗 

明膠液化實驗 

（1）原理： 某些可以產(chǎn)生一種胞外蛋白水解酶(明膠酶)，能使明膠分解為氨基酸，使明膠失去凝固能力而液化，因而使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動的液體。 

（2）實驗方法： 取18～24h的斜面培養(yǎng)物穿刺接種，并有兩支未接種的空白對照。 

（3）結(jié)果觀察： 于30℃培養(yǎng)20天后觀察，明膠液化的為陽性。由于室溫下明膠培養(yǎng)基呈液狀，因此在觀察結(jié)果時，應將其放置于4℃的冰箱中30分鐘后拿出觀察。若明膠仍能全部凝固，為陰性，有部分或全部不能凝固為陽性。

 吲哚實驗 

（1）原理： 某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當加入吲哚試劑后則形成紅色的玫瑰吲哚。 

（2）培養(yǎng)基： 蛋白胨水培養(yǎng)基。 

（3）實驗方法： 將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35℃孵育24~48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑，觀察結(jié)果。 

（4）結(jié)果： 于兩液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。 

（5）應用： 主要用于腸桿菌科細菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。 

硫化氫試驗 

（1）原理： 某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結(jié)合形成黑色沉淀物(硫化鐵或硫化鉛沉淀)。 

（2）實驗方法： 將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中，于35℃孵育24h -48h，觀察有無黑色沉淀出現(xiàn)。 

（3）結(jié)果： 培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?nbsp;

（4）應用： 主要用于鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺、豬霍亂沙門菌等。

 尿素分解試驗 

（1）原理： 某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。 

（2）培養(yǎng)基： 尿素培養(yǎng)基。 

（3）實驗方法： 將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35℃孵育18~24h小時觀察結(jié)果。 

（4）結(jié)果： 培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮浴?nbsp;

（5）應用： 主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性，另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。 

苯丙氨酸脫氨酶試驗 

（1）原理： 測定細菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應。 

（2）培養(yǎng)基： 苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。 

（3）實驗方法： 將待檢菌大量接種入苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基中，35℃孵育18~24h，滴加10% 三氯化鐵試劑3~4滴，自斜面上方流下。

（4）結(jié)果： 有綠色出現(xiàn)為陽性。應立即觀察結(jié)果，延長反應時間會引起退色。 

（5）應用： 主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細菌均為陰性。

 氨基酸脫羧酶試驗 

（1）原理： 某些細菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來。 

（2）培養(yǎng)基： 氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基。 

（3）實驗方法： 將待檢菌分別接種于1支氨基酸(賴氨酸，鳥氨酸或精氨酸)脫羧酶試驗管1支氨基酸脫羧酶對照管(無氨基酸)，各覆蓋至少12.5px高度的無菌石蠟油，35℃孵育1~4d，每日觀察結(jié)果。 

（4）結(jié)果： 對照管應為黃色，若為溴甲酚紫指示劑，則測定管呈紫色則為陽性，若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現(xiàn)紫色則試驗無意義，不能做出判斷。 

（5）應用： 主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。如，沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。 

（三）碳源和氮源的利用實驗 

weiyi碳源利用實驗 

（1）原理： 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基只提供一種待檢測碳源，若菌株生長則表明菌株能以此種碳源為weiyi碳源，否則不能。 

（2）培養(yǎng)基： 基本培養(yǎng)基： (NH4)2HPO41g；NaCl 1g；MgSO4•7H2O 0.2 g；KH2PO40.5 g；瓊脂20g；蒸餾水1000mL；pH7.0-7.2。 各種碳源的終濃度如下： 糖類及其衍生物(醇類，糖苷類等)：1%，w/v；多醇和甘油：1%，w/v；苯甲酸鹽，二酸鹽，其它單酸鹽：0.1%，w/v。糖類及其衍生物和多醇要求過濾除菌，鹽類可加入培養(yǎng)基一起滅菌。 

（3）實驗方法： 將純的菌株接種到培養(yǎng)基后培養(yǎng)14~28d，觀察其生長情況，以不加碳源的培養(yǎng)基作對照。能夠生長為陽性。 

weiyi氮源利用實驗 

（1）原理： 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基只提供一種待檢測氮源，若菌株生長則表明菌株能以此種氮源為weiyi碳源，否則不能 

（2）培養(yǎng)基： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： D-Glucose1g；MgSO4•7H2O0.05 g；NaCl 0.05 g；FeSO4•7H2O 0.001 g；KH2PO4 0.01 g。不同氮源按0.5%的濃度加入。 

（3）實驗方法： 將純的菌株接種到培養(yǎng)基后培養(yǎng)14~28d，觀察其生長情況，以不加氮源的培養(yǎng)基作對照。能夠生長為陽性。 

（四）各種酶類實驗 

氧化酶試驗 

（1）原理： 氧化酶(即細胞色素氧化酶)，是細胞色素氧化酶系統(tǒng)中的終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。因此，本試驗結(jié)果與細胞色素C的存在有關(guān)。 

（2）實驗方法： 菌落法：直接滴加試劑于被檢菌落上；濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，蘸取菌少許，然后加試劑；試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。 

（3）結(jié)果： 細菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色，為陽性。無色為陰性。為保證結(jié)果的準確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。 

（4）應用： 主要用于腸桿菌科細菌和假單胞菌屬的鑒別，前者陰性，而后者陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應。

 過氧化氫酶試驗(觸酶試驗) 

（1）原理： 具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。 

（2）實驗方法： 取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細菌，加3%過氧化氫數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。 

（3）結(jié)果： 若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。 

（4）應用： 革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故該試驗常用于革蘭陽性球菌的初步分群。